Določanje krvnih skupin z uporabo ciklonov

DOLOČANJE KRVNE SKUPINE PO SISTEMU ABO

PLASMA ANTIGENS

Plazemski (serumski) antigeni so določeni kompleksi aminokislin ali ogljikovih hidratov na površini beljakovinskih molekul krvne plazme (seruma).

KONCEPT KRVNE SKUPINE

KRVNA SKUPINA - kombinacija normalnih imunoloških in genetskih znakov krvi, ki je dedno določena in je biološka lastnost vsakega posameznika.

Krvne skupine se dedujejo, nastanejo v 3-4 mesecih razvoja ploda in ostanejo nespremenjene skozi celo življenje. Menijo, da pri ljudeh krvna skupina vključuje več deset antigenov v različnih kombinacijah. Teh kombinacij - krvnih skupin - je dejansko lahko več milijard. V praksi so identični le pri istovetnih dvojčkih z istim genotipom..

V praktični medicini izraz krvna skupina praviloma odraža kombinacijo eritrocitnih antigenov sistema ABO in Rh faktorja ter ustreznih protiteles v krvnem serumu.

Za vsak znani antigen smo našli protitelesa z istim imenom (anti-A, anti-B, anti-Rhesus, anti-Kell itd.). Protitelesa krvne skupine niso tako stalna lastnost človeškega telesa kot antigeni. Le v sistemu skupine ABO so protitelesa normalno prirojena lastnost krvne plazme. Ta protitelesa (aglutinini a in b) so stalno prisotna v človeški plazmi.

1. KRVNE SKUPINE O ABO

Izraz "združljivost" pomeni kombinacijo krvi darovalca in prejemnika antigenov in protiteles, ki ne povzroča imunoloških interakcij.

Glede na prisotnost aglutinogenov A in B v rdečih krvnih celicah ter v serumu ustreznih aglutininov a in b so vsi ljudje razdeljeni v štiri skupine:

• Skupina O (I) - v rdečih krvnih celicah ni aglutinogenov, aglutininov a in b v serumu.

• Skupina A (II) - aglutinogen A v rdečih krvnih celicah, aglutinin b v serumu.

• Skupina B (III) - aglutinogen B v rdečih krvnih celicah, aglutinin a v serumu.

• Skupina AB (IV) - aglutinogena A in B v rdečih krvnih celicah, brez aglutininov v serumu.

Antigen A ni homogen, obstajata ga dve glavni podvrsti: Glede na to ima skupina A (II) dve podskupini A (P) in A₂ (II) in skupini AB (IV) - AB (IV) in A₂V (iv).

Skupinski antigen B je bolj enoten, čeprav so opisane njegove redke različice. Vendar to nima pomembnega kliničnega pomena.

Skupinsko krvno pripadnost po sistemu ABO določimo s pomočjo aglutinacijske reakcije. Trenutno obstajajo tri metode za določanje krvnih skupin po sistemu ABO:

• za standardne izohemaglutinirajoče serume,

• za standardne izohemaglutinirajoče serume in standardne rdeče krvne celice (metoda preseka),

• z uporabo monoklonskih protiteles (cikloni anti-A in aichi-B).

V rutinski študiji bolnišnični zdravnik določi krvno skupino s standardnimi izohemaglutinirajočimi serumi ali s pomočjo ciklonov, nakar pošlje kri v serološki laboratorij, da s pomočjo metode preseka preveri skupino..

Krvna skupina velja za opredeljeno le, če je laboratorij potrdil podatke, ki jih je pridobil bolnišnični zdravnik. Če se rezultati raziskav razlikujejo, je treba obe študiji ponoviti..

V nujnih primerih (kadar krvavitev potrebuje nujno transfuzijo krvi) bolnišnični zdravnik sam določi skupino (v laboratoriju se opravi pregled, vendar po dejstvu).

DOLOČANJE KRVNIH SKUPIN S STANDARDNIMI IZGEMAGLUTINIZACIJSKIM SERIJOM

Najpogostejši v klinični in laboratorijski praksi.

Bistvo metode je odkrivanje skupin antigenov A in B v testni krvi z uporabo standardnih izohemaglutinirajočih serumov. Izvedeno v sobi z dobro osvetlitvijo pri temperaturi 15-25 ° C.

a) Zahtevana oprema

• Standardni izohemaglutinirajoči serumi skupin O (I), A (II), B (III) in AB (IV) dveh različnih serij. Serum mora biti transparenten, brez znakov propadanja. Za udobje so standardni hemaglutinirajoči serumi različnih skupin tonirani v določeno barvo: O (I) - brezbarven (siv), A (II) - modra, B (III) - rdeča, AB (IV) - svetlo rumena. Upoštevati je treba, da te barve spremljajo vse oznake na krvnih izdelkih, ki imajo skupinsko pripadnost (kri, masa eritrocitov, plazma itd.).

• plošče iz belega porcelana ali emajla ali katere koli druge plošče z mokro površino, označene z 0 (1), A (P), H (W), AB (IV).

• Izotonična raztopina natrijevega klorida.

• Igle, pipete, steklene palice (stekleni diapozitivi).

b) Reakcijska tehnika

1. Na krožnik (ploščo) nanesite standardni izohemaglutinirajoči serum I, II, III skupin v prostornini 0,1 ml (ena velika kapljica v premeru približno 1 cm). Da bi se izognili napakam, uporabimo dve vrsti serumov vsake skupine. Skupaj 6 kapljic.

2. Šest kapljic testne krvi, približno velikosti glave pin (0,01 ml) (majhna kapljica), zaporedoma s suho stekleno palico prestavimo na ploščo s 6 točkami, vsaka poleg kapljice standardnega seruma (količina testne krvi mora biti približno 10-krat manjša od količine običajnega seruma ), nato jih previdno pomešamo s pomočjo steklenih palic z zaobljenimi robovi.

3. Po mešanju plošče občasno pretresite.

Aglutinacija se začne v prvih 10-30 sekundah.

4. V kapljice, kjer je prišlo do aglutinacije, dodajte eno kapljico izotonične raztopine natrijevega klorida, po kateri ocenite rezultat reakcije..

S pozitivno reakcijo se običajno v prvih 10-30 sekundah v mešanici pojavijo majhna rdeča zrna (aglutinate), sestavljena iz lepljenih rdečih krvnih celic, vidnih s prostim očesom.

Če so serumi vseh treh skupin dali pozitivno reakcijo, to kaže, da testna kri vsebuje aglutinogene - A in B in spada v skupino AB (IV). Vendar pa je v takih primerih za izključitev nespecifične aglutinacijske reakcije (hladna aglutinacija, panglutinacija, alergija) treba izvesti dodatno kontrolno študijo preskusne krvi s standardnim izohemaglutinirajočim serumom skupine AB (IV), ki ne vsebuje aglutininov. Samo odsotnost aglutinacije v tej kapljici ob prisotnosti aglutinacije v kapljicah, ki vsebujejo standardne serume skupin 0 (1), A (II) in B (III), nam omogoča, da ocenimo reakcijo kot specifično in dodelimo testno kri skupini AB₀ (Iv).

Treba je opozoriti, da se v prisotnosti šibkega podtipa antigena A v preskusni krvi reakcija aglutinacije s hemaglutinirajočimi serumi skupine 0 (1) in B (III) začne kasneje (3-4 minute). Za natančno določitev podtipa antigena A je potrebna dodatna reakcija s tako imenovanim reagentom anti-A.

DOLOČANJE KRVNIH SKUPIN S STANDARDNIMI IZGHEMAGLUTINIZACIJO SERUMSKIH IN STANDARDNIH EKRITROKITOV (KRVNI METOD)

Metoda se najpogosteje uporablja v seroloških laboratorijih. Bistvo metode je določiti prisotnost ali odsotnost v testni krvi antigena A in B skupine A z uporabo standardnih izo-hemaglutinirajočih serumov, kot tudi skupinskih protiteles a in b s standardnimi rdečimi krvnimi celicami.

• Oprema za reakcijo s standardnimi rdečimi krvnimi celicami je drugačna, saj so za reakcijo aglutinacije potrebne standardne rdeče krvne celice treh krvnih skupin: 0 (1), A (II), B (III).

• Standardne rdeče krvne celice se pripravijo iz krvi darovalcev z prej znano krvno skupino, ki se hranijo pri 4-8 ° C.

En velik kapljico testnega krvnega seruma iz epruvete (0,1 ml) nanesemo na označeno ploščo s pipeto v šestih celicah, poleg njih pa še ena majhna kapljica (0,01 ml) standardnih rdečih krvnih celic skupin 0 (1), A (P), H (š) (dve seriji).

Značilnost interpretacije rezultatov reakcije s standardnimi eritrociti je, da so eritrociti skupine 0 (1) kontrolni (v njih ni antigenov, kar načeloma onemogoča specifično aglutinacijsko reakcijo s katerim koli serumom).

DOLOČANJE KRVNIH SKUPIN PO MONOKLONALNIH PREDELAVAH

Za določitev krvne skupine se uporabljajo monoklonska protitelesa, za katera se uporablja hibridomska biotehnologija..

Hibridom je celični hibrid, ki nastane z zlivanjem tumorske celice kostnega mozga (mieloma) z imunskim limfocitom, ki sintetizira specifična monoklonska protitelesa. Hibridom pridobi lastnosti obeh "staršev": sposobnost neomejene rasti, značilne za tumorsko celico, in sposobnost sinteze protiteles, ki so lastna imunskemu limfocitu.

Razviti so bili standardni reagenti - monoklonska protitelesa (MABs): anti-A in anti-B kolikloni, ki se uporabljajo za določanje aglutinogenov eritrocitov. Tsoliklon je liofiliziran prašek rdeče (anti-A) ali modre (anti-B) barve, ki ga razredčimo z izotonično raztopino natrijevega klorida neposredno pred študijo.

Ciklonske ciklone proti A in A proti B nanesemo na belo tableto, ena velika kapljica (0,1 ml) pod ustreznimi nalepkami: anti-A ali anti-B. Poleg kapljic protiteles nanesemo še eno majhno kapljico (0,01 ml) testne krvi. Po mešanju komponent opazimo reakcijo aglutinacije 2-3 minute.

K. Landsteiner in A. S. Wiener sta leta 1940 v človeških eritrocitih odkrila povsem nov antigen, ki so ga poimenovali Rh faktor (Rh). Rezusov faktor je prisoten v krvi 85% ljudi, 15% posameznikov pa tega dejavnika ne vsebuje. Tako ga imenujejo po imenu Macak Rhesus, ki ga ima vedno.

Rezusni antigeni so razvrščeni kot lipoproteini. So zelo aktivni in lahko povzročijo tvorbo imunskih protiteles..

Prisotnost rezusnega antigena se odkrije pri človeškem plodu od 5. do 8. tedna in se dobro izrazi pri 3-4 mesečnem starem zarodku.

Datum dodajanja: 06.01.2014; Ogledi: 7636; kršitev avtorskih pravic?

Vaše mnenje nam je pomembno! Je bilo objavljeno gradivo v pomoč? Da | Ne

Metode določanja krvne skupine

Vsaka oseba si je koristno zapomniti svojo krvno skupino. To lahko pride v poštev v izrednih razmerah. Ni za nič, če ima vojaško osebje krvno skupino v tuniki ali žetonih. Težav, kako določiti krvno skupino, ne obstaja. V velikih bolnišnicah to počnejo laboratoriji. Toda tudi v majhnih podeželskih ambulantah obstajajo standardni pripomočki za določanje skupine in vsi zdravniki in paramedicinski delavci so sposobni analizirati. Če to delajo strokovnjaki, je neuporabno.

Kakšno krvno skupino pri otroku lahko domnevajo starši. Na primer, če vemo, da imajo starši drugo, tretjo ali četrto, ne bi smeli upati, da bo otrok imel prvo.

Nasveti za domačo opredelitev

Takšen nasvet dajo ljudje, ki "živijo" na internetu in zbirajo kakršne koli podatke brez razlikovanja. Včasih to spremenijo po svoje.

Dejansko obstaja teorija prehrane, odvisno od vrste krvi, in poskušali so z njo povezati značaj osebe. Vendar je bil zasnovan tako, da izbere najustreznejšo prehrano, preprečevanje bolezni. Celo psihologi so nehali govoriti o odnosu med osebnostno vrsto in krvnim številom..

Poleg tega po svojih najljubših jedeh ali nagnjenosti k vodstvu o svoji skupini ne morete soditi.

Doma se naučite nekaj boljšega iz polnih člankov, strokovnih nasvetov. Morda obstajajo medicinski dokumenti (ambulantna izkaznica, izvlečki iz bolnišnice), ki vsebujejo podatke o vaši krvi.

Na zahtevo darovalcev in bolnišničnih bolnikov se lahko s temi podatki ožigosa potni list.

Kdo je izumil krvne skupine

Pionir štirih krvnih skupin je avstrijski znanstvenik in zdravnik K. Landsteiner, ki je za to prejel leta 1930 Nobelovo nagrado za medicino. Odkritje je omogočilo preprečevanje smrti zaradi transfuzije, predhodno proučevanje združljivosti lastnosti darovalca in prejemnika.

Bistvo predlaganega sistema AB0 je prisotnost antigenih struktur na rdečih krvnih celicah pri ljudeh in živalih. Tipična protitelesa (gamaglobulini) nanje v plazmi niso na voljo. Zato lahko za določitev uporabimo reakcijo antigen + protitelo.

Lepljenje rdečih krvnih celic se zgodi med srečanjem antigena z njegovim protitelesom. Ta reakcija se imenuje hemaglutinacija. Med analizo je vidna v obliki majhnih kosmičev. Določanje krvne skupine temelji na značilnem vzorcu aglutinacije v serumu..

Eritrocitni antigeni tipa A se vežejo na protitelesa ά oziroma B na β. Sestava dodeljene krvi:

• I ali 0 (ά, β) - na površini rdečih krvnih celic sploh ni antigenov;
• II ali A (β) - vsebujejo antigen A s protitelesom β;
• III ali B (ά) - obstaja antigen tipa B s protitelesom ά;
• IV ali AB (00) - ima oba antigena, vendar ne vsebuje protiteles.

Antigeni so v človeškem zarodku prisotni že v embrionalnem obdobju, protitelesa (aglutinini) pa se pojavijo v serumu novorojenčkov v prvem mesecu življenja.

Standardna definicija krvne skupine (enostavna metoda)

Za izvedbo analize krvne skupine so potrebni pacientovi eritrociti (odvzeti jih iz kapljice krvi) in standardni serumi, ki vsebujejo znane antigene.

Velika kapljica štirih serumov je postavljena v dve vrsti na ravno ploščo v dveh vrsticah (dovolj sta le III in II, vendar sta za nadzor vzeta 1 in 1V). Z različnimi steklenimi paličicami (priročno je uporabljati kapalke za oči) se kapljicam seruma doda (izmeri približno 1:10) testni krvi in ​​nežno premešamo.

Ploščo pretresite pet minut, da se serumi dobro mešajo s krvjo.

Dešifriranje rezultatov

5 minut traja in rezultate analize je mogoče oceniti. V velikih kapljicah pride do razsvetljenja seruma, v nekaterih majhnih kosmičih (aglutinacijska reakcija), pri drugih ne. Tu so možnosti:

• če v obeh vzorcih ni aglutinacije s serumi skupin III in II (+ kontrolni 1 in 1V) - to je prva skupina;
• če je koagulacija zaznana pri vseh razen II - to kaže na drugo skupino;
• če ni aglutinacije samo s serumom III, se ugotovi tretja krvna skupina;
• če je koagulacija zaznana v vseh vzorcih, vključno s 1V kontrolno skupino štiri.

Ko so serumi v pravilnem vrstnem redu, so na ploščici nameščeni podpisi, je enostavno krmariti: kjer ni aglutinacije, takšna skupina.

Obstajajo časi, ko vezava ni jasna. Nato se analiza naredi, drobna aglutinacija se pregleda pod mikroskopom.

Metoda navzkrižne reakcije

Za razjasnitev skupine z neizraženo aglutinacijo se uporablja metoda dvojne navzkrižne reakcije s standardnimi rdečimi krvnimi celicami. V tem primeru ne poznamo seruma, kot v preprosti metodi, temveč rdeče krvne celice. Pri bolniku se kri odvzame v epruveti, centrifugira in od zgoraj črpa serum za testiranje cevi..

2 veliki kapljici seruma bolnika kapljata na ravno belo ploščo. Dodajo standardne rdeče krvne celice A (II) in B (III) krvne skupine. Postopoma mešamo, stresemo krožnik.

Rezultat se oceni po 5 minutah:

• če se aglutinacija pojavi v obeh kapljicah, skupina ena;
• če ni v nobenem vzorcu, četrta skupina;
• če v eni od uporabljenih znanih rdečih krvnih celic določimo skupino glede na prisotnost ali odsotnost koagulabilnosti v kapljici.

Opredelitev skupine po ciklonih

Cikloni so sintetični nadomestki sirotke. Vsebujejo umetne nadomestke aglutininov ά in β. Eritrotesti se imenujejo "Tsoliklon anti-A" (roza) in "anti-B" (modra). Pričakovana aglutinacija se pojavi med rdečimi krvnimi celicami testne krvi in ​​aglutinini ciklonov.

Tehnika ne zahteva uporabe dveh serij, velja za bolj natančno in zanesljivo. Vodenje in ocenjevanje rezultatov sta enaka kot pri enostavni standardni metodi.

Značilnost: četrto skupino AB (IV) nujno potrdi reakcija aglutinacije s specifičnim ciklom anti-AB in odsotnost nespecifičnega adhezije rdečih krvnih celic v izotonični raztopini natrijevega klorida.

Express metoda z uporabo skupin kartic Erytrotest

Metoda omogoča določitev skupine in Rh faktorja v laboratorijskih in terenskih pogojih. Komplet vključuje kartico z luknjami. Posušeni reagenti so že bili naneseni na dno vdolbinic. Tu se poleg "anti-A", "anti-B" in "anti-AB" uporablja tudi "anti-D", kar daje rezultat Rh faktorja.

Kri lahko uporabite v kateri koli obliki, primerna je povezava s konzervansom in odvzeta iz prsta.

Pred raziskavo se na kartico zapiše ime pacienta, v vsako vdolbinico se doda kapljica vode, da se sestavine raztopijo. Nato z ločenimi palicami dodamo kri v vdolbinice reagenta in rahlo premešamo. Končni rezultat je "prebran" po treh minutah.

Krvno skupino vedno preverimo, če je potrebno transfuzijo. Hkrati združljivost kontrolne skupine in posameznika. Dejansko je bilo v človeški krvi veliko več antigenih lastnosti kot v sistemu AB0. Samo, da se pri večini prebivalstva šibko manifestirajo.

Toda pri bolniku s hudimi boleznimi, ki spremenijo lastnosti krvi in ​​alergijo na telo, postanejo odločilne, upoštevati jih je treba s prisotnostjo in nivojem v krvi. Zato bolnikovo poznavanje lastne skupine dodaja samozavest kot rezultat študije.

Določitev navzkrižne krvi

Navodila za določanje krvnih skupin, ki obstajajo v Rusiji, so trenutno zastarela in ne upoštevajo številnih dosežkov sodobne transfuziologije. V hematološkem znanstvenem centru Ruske akademije medicinskih znanosti se pripravljajo metodološka priporočila ob upoštevanju dosežkov svetovne transfuziologije, ki jih povzemata Svetovna zdravstvena organizacija in Ameriško združenje krvnih bank. Te smernice so predstavljene spodaj..

METODOLOŠKA PRIPOROČILA ZA DOLOČANJE O KRVENIH SKUPINAH

Odobril direktor
Hematološka
Znanstveno središče RAMS
Akademik A.I. Vorobiev
27.04.1999

Kri vsake osebe spada v katero koli od 4 skupin sistema ABO, odvisno od prisotnosti antigenov A in B na rdečih krvnih celicah ter ustreznih protiteles proti A in A proti B v plazmi. V skupini 0 (1) sta oba antigena odsotna, v skupini A (II) - na rdečih krvnih celicah je prisoten le antigen A, v skupini B (III) - le rdeča krvna celica in v skupini AB (IV) - oba sta hkrati prisotna na rdečih krvnih celicah antigen - A in B. Običajno imajo neimunizirani ljudje v plazmi naravna protitelesa proti manjkajočemu antigenu: pri posameznikih skupine 0 (I) protitelesa proti obema antigenoma A in B odkrijeta; pri osebah skupine A (II) - protitelesa proti B; v skupini B (III), protitelesa proti A in nazadnje v skupini AB (IV) protitelesa tega sistema v plazmi ni. Zaradi dejstva, da je kompatibilnost s sistemom ABO najpomembnejša pri izvajanju transfuzij krvi, je treba določiti krvno skupino sistema ABO s prečnim presekom, tj. eritrocitni antigeni in protitelesa v plazmi (serum). Vzporedna študija antigenov rdečih krvnih celic in aglutininov v serumu je obvezna za dajalce in prejemnike. Pri transfuziji krvi lahko glede na vitalne indikacije prejemniško skupino določimo le z eritrocitnimi antigeni, hkrati pa se naredi test za posamezno združljivost prejemnikovega seruma z donatorskimi eritrociti. Upoštevati je treba, da obstajajo sorte antigena B in v večji meri antigena A. Najpogostejši sorti antigena A sta A1 in A2. Antigen A2 se pojavlja pri približno 20% ljudi v skupinah A (II) in AB (IV). Pri rutinskem tipkanju ni potrebe po posebni dodelitvi podskupin A2 (II) in A2B (IV), saj ljudje z antigenom A2 običajno nimajo protiteles proti antigenu A1 in jih je mogoče transfuzirati po splošnih pravilih. Prisotnost takšnih "presežnih" protiteles odkrijemo s navzkrižnim določanjem krvne skupine in v vzorcu za posamezno združljivost. Pogostost pojava protiteles anti-A1 je 1-8% pri ljudeh skupine A2 (II) in 22-35% pri ljudeh A2B (IV). Če pri takšnih ljudeh odkrijemo protitelesa proti A1, je koristno potrditi prisotnost antigena A2 s posebnimi reagenti (monoklonski reagent proti antigenu A1 ali Dolichos biflorus lektin), ki aglutinirajo samo A1 rdeče krvne celice. Pri posameznikih iz skupin A2 (II) in A2B (IV) z anti-A1 protitelesi lahko rdeče krvne celice prelijemo samo z antigeni A2 ali A2B.

Aglutinini anti-A (alfa) in anti-B (beta) se določijo v neposredni reakciji aglutinacije standardnih rdečih krvnih celic A1 in B s testnim serumom.

Antigene proučenih rdečih krvnih celic določimo v reakciji neposredne aglutinacije z uporabo standardnih reagentov, ki vsebujejo popolna protitelesa proti A in / ali anti-B. Ti reagenti so lahko aloimunski serumi, pridobljeni od imunskih darovalcev, ali monoklonska protitelesa. Uporaba izohemaglutinirajočih serumov neimunskih darovalcev ni priporočljiva zaradi njihove nezadostne aktivnosti proti šibkim različicam antigenov in nestandardnih.

Uporabljeni standardni reagenti morajo biti certificirani v skladu z mednarodnimi zahtevami. Certificiranje standardov izvaja referenčni laboratorij Znanstvenega centra za hematologijo enkrat letno za vsako ustanovo, ki proizvaja reagente za tipkanje. Institucija standardizira vsako serijo reagenta v skladu s certificiranim standardom. Standardi morajo izpolnjevati naslednje zahteve: 1). biti specifičen; 2). imajo v testnem testu vsaj 1: 1024 za anti-A in anti-B reagente z rdečimi krvnimi celicami A1 in B; 3). v testnem testu ima titer vsaj 1: 256 za reagent anti-A z rdečimi krvnimi celicami A; 4). povzroči jasno aglutinacijo na ravnini 2-3 sekunde po mešanju reagentov z izpranimi rdečimi krvnimi celicami A1 ali B in najpozneje 5 sekund po mešanju z opranimi rdečimi krvnimi celicami A2.

Krvno skupino darovalcev določi zdravnik ali laboratorijski asistent 2-krat: enkrat ob začetnem zdravljenju darovalca in drugič ob sprejemu k dajalcu. Rezultati obeh določitev se zapišejo na sprednji strani revije darovalca, pri čemer se navede datum in podpišejo osebe, ki so določile krvno skupino. V prihodnosti se krvna skupina določi pred vsako preskrbo s krvjo.

Krvno skupino prejemnikov določi certificirani transfuziolog ali posebej usposobljena medicinska sestra. Rezultati določanja krvne skupine se zabeležijo v zgornjem desnem kotu sprednjega lista zdravstvene anamneze, pri čemer se navede datum in podpiše specialist, ki je opravil določitev. Določitev krvne skupine se ponovi pred transfuzijo..

Ugotavljanje krvne skupine ABO s prečnim prerezom.

I. Določanje antigenov A in B rdečih krvnih celic z imunskimi poliklonalnimi serumi ali monoklonskimi reagenti.

Krvno tipkanje je treba izvesti z dvema serijama anti-A in anti-B reagentov ali po eno serijo vsakega reagenta, če se uporablja tudi anti-AB reagent, kar je dodaten nadzor pravilne določitve krvne skupine ABO z anti-A in anti-B reagenti.
Določitev se izvede v sobi z dobro osvetlitvijo pri temperaturi 15-25 °. Za raziskavo z uporabo polne krvi, izpranih rdečih krvnih celic, rdečih krvnih celic v plazmi, serumu ali fiziološki raztopini.
1. Označite odseke na plošči ali plošči z imenom reagenta.
2. Dajte po 1 veliko kapljico (približno 0,1 ml) vsakega reagenta: anti-A, anti-B in anti-AB.
3. Poleg vsakega reagenta dajte 1 majhno kapljico (približno 0,03 ml) testne krvi (rdečih krvnih celic).
4. Zmešajte vsako kapljico krvi (rdeče krvne celice) z ustreznim reagentom v ločenih čistih steklenih palicah..
5. Nežno zibajte ploščo. Kljub temu, da pri uporabi standardnih reagentov pride do jasne aglutinacije že v prvih sekundah, upoštevajte rezultate reakcije 3 minute po koncu mešanja, da ne bi zamudili šibkih oblik antigenov.
6. Rezultate reakcije zapišite takoj po določitvi..

II. Določitev aglutininov anti-A in anti-B v krvnem serumu s standardnimi rdečimi krvnimi celicami.

Kot standardne rdeče krvne celice je treba uporabiti eritrocite darovalcev skupin A1 in B. Rdeče krvne celice se hranijo v hladilniku največ en teden. V posebnem konzervansu se lahko poveča rok uporabnosti rdečih krvnih celic. Uporaba liziranih rdečih krvnih celic ni dovoljena. Uporabite lahko rdeče krvne celice enega predhodno vpisanega darovalca (za vsako skupino) ali mešanico rdečih krvnih celic od 2-3 darovalcev (za vsako skupino).
1. Pripravite 5% suspenzijo v fiziološki raztopini standardnih rdečih krvnih celic, ko ste enkrat izpereni v fiziološki raztopini.
2. V dve epruveti damo 2 kapljici testnega seruma (plazme).
3. Dodajte 1 kapljico 5% suspenzije rdečih krvnih celic skupine A v epruveto A in kapljico rdečih krvnih celic skupine B v epruveto B, temeljito premešajte in 5 minut inkubirajte pri sobni temperaturi..
4. Centrifugirajte epruvete pri 2000 vrt./min. 30 sekund (priporočljivo je izbrati optimalni čas in hitrost centrifugiranja za uporabljeno centrifugo, tako da se usedlina zlahka loči od dna cevi).
5. Stresajte epruveto, olupite od spodaj in nežno stresite usedlino eritrocita.
6. Določite prisotnost aglutinatov tako, da cev pogledate v svetlobo..
7. Zapišite rezultate določitve..

III. Interpretacija rezultatov in vzpostavitev krvne skupine

* Znak plus (+) označuje prisotnost aglutinacije, znak minus (-) pa kaže na odsotnost aglutinacije.

IV. Neskladje med rezultati določanja krvne skupine ABO po eritrocitnih antigenih in serumskih aglutininih.

Če se rezultati obeh testov pri pregledu krvi darovalca ne ujemajo, te krvi ni mogoče uporabiti za transfuzijo, dokler se ne ugotovijo razlogi za odstopanje.

Če se neskladje nanaša na kri prejemnika, ki potrebuje nujno transfuzijo krvi, mu mora nato preliti kri (rdeče krvne celice) skupine 0 (1), ki je združljiva s faktorjem Rh.

Glavni vzroki napak

1. Tehnične napake: uporaba kontaminirane opreme; napačno razmerje seruma in celic; premočno centrifugiranje (lažno pozitivno); nezadostno centrifugiranje (lažno negativen rezultat); kontaminacija standardnih reagentov z reagenti druge skupine; izvedba reakcije pri temperaturi nad 25 ° (lažno negativen rezultat); nepravilno označevanje reagentov, rdečih krvnih celic ali napačno beleženje rezultatov.

2. Napake, povezane z nenormalnimi lastnostmi testiranih rdečih krvnih celic:
- šibke oblike antigena A (pogosteje) ali B. Serum lahko vsebuje dodatna protitelesa, ustrezen antigen na rdečih krvnih celicah pa ni zaznan. Potrebno je opraviti drugo študijo rdečih krvnih celic z uporabo drugih serij reagentov in druge laboratorijske steklovine. Priporočljivo je, da preučenih rdečih krvnih celic večkrat operemo in čas registracije povečate na 5 minut. Če rezultati ob ponovnem določanju ne sovpadajo, je treba takšno kri poslati v specializiran serološki laboratorij na pregled.
- poliaglutinabilnost eritrocitov, kadar vsi reagenti ABO povzročajo isto aglutinacijo. V tem primeru je treba preveriti, ali preučeni eritrociti aglutinirajo v standardnem serumu skupine AB (IV) (če je tipkanje izvajal imunski serum) ali v fiziološki fiziološki raztopini (če so bili uporabljeni monokloni). Običajno lahko poliaglutinacijo odpravimo s ponovnim umivanjem rdečih krvnih celic..
- nastanek "kovancev kovancev" je mogoče zamenjati za aglutinacijo. V tem primeru, ko dodamo 1-2 kapljice fiziološke raztopine in ploščo stresemo, ponavadi lažna aglutinacija izgine..
- mešana aglutinacija (krvna himera), ko se del rdečih krvnih celic nabere v aglutinatih, ostali pa ostanejo prosti. Najpogosteje to opazimo pri bolnikih skupin A, B ali AB v 1–3 mesecih po transfuziji velikih količin krvi skupine 0 (1) ali po presaditvi kostnega mozga skupine 0 (1); manj pogosto - pri heterogenih dvojčkih. Temeljita zgodovina hitro razkrije to situacijo..
- eritrociti, občutljivi na protitelesa in / ali dopolnjujejo pri hemolitični bolezni novorojenčka, avtoimunskih in nalezljivih boleznih. Takšne rdeče krvne celice lahko spontano aglutinirajo z imunskimi serumi. Določitev ponovimo z monoklonskimi reagenti, damo neposredni Coombsov test (glej spodaj).

3. Napake, povezane z nenormalnimi lastnostmi preskusnega seruma:
- standardne rdeče krvne celice v prisotnosti testnega seruma tvorijo kovanske kolone, kar lahko vzamemo kot pozitiven rezultat. Dodajanje 1-2 kapljic fiziološke raztopine v epruveto in nežno drsenje običajno uniči kovance kovancev, ne pa pravih aglutinat. Nepravilni rezultat reakcije potrdite tako, da ponovite s standardnimi rdečimi krvnimi celicami skupine 0 (1).
- v serumu ni protiteles proti A ali A proti B, kar opažamo pri novorojenčkih, pa tudi pri bolnikih s hudimi motnjami imunskega sistema. Zaključek o krvni skupini je narejen glede na rezultate študije antigenov rdečih krvnih celic.
- protitelesa drugačne specifičnosti ali prekomerna protitelesa so prisotna v serumu (na primer anti-A1 pri ljudeh s šibkim antigenom A2). Rezultat testa združljivosti (glej Smernice za izvajanje posameznega testa združljivosti krvi dajalca in prejemnika) je v takih primerih edino merilo za odvzem krvi.

METODOLOŠKA PRIPOROČILA ZA DOLOČANJE DODATKOV ZA KRVENO REZULTATO

Na človeških rdečih krvnih celicah je 5 glavnih antigenov Rhesusovega sistema (D, C, c, E, e), od katerih je najbolj imunogen antigen D [njegova celotna oznaka je Rh 0 (D)]. Prisotnost ali odsotnost tega antigena določa Rhesusovo pripadnost krvi: osebe, ki vsebujejo D-antigen, spadajo v skupino pozitivnih rezusov (približno 85% bele rase); osebe, ki ne vsebujejo D-antigena, so Rh-negativne (približno 15%).

Imunogenost drugih (manjših) Rh antigenov je znatno nižja in se zmanjša v naslednjem vrstnem redu: c> E> C> e. Določanje manjših antigenov Rhesusovega sistema se običajno izvede s posamično izbiro krvi za več transfuzij, v primerih, ko se v serumu prejemnika odkrijejo imunska protitelesa proti Rh antigenom, pa tudi pri ženskah v rodni dobi..

Antigen D ima šibke različice, združene v skupino D u, kar predstavlja približno 1% populacije. Rdeče krvne celice D u šibko ali sploh ne aglutinirane s polnimi anti-Rh protitelesi v neposredni aglutinacijski reakciji. Za njihovo določitev je treba v reakciji aglutinacije z antiglobulinskim reagentom (indirektni Coombsov test) uporabiti nepopolna protitelesa proti rezusu. Krvodajalci in prejemniki se različno testirajo na prisotnost antigena D u.

Darovalce, ki vsebujejo D u, je treba razvrstiti med Rh-pozitivne, saj lahko transfuzija njihove krvi z Rh-senzibiliziranih Rh-negativnih prejemnikov povzroči hude transfuzijske reakcije. Krvodajalce je treba testirati na prisotnost D u in jih, če jih odkrijemo, razvrstiti kot Rh-pozitivne.

Večina negativnih rezusnih posameznikov ima fenotip dce, vendar pa 2-5% posameznikov, ki ne prenašajo antigena D na rdeče krvne celice in rezus-negativne po definiciji, ima fenotip dCe ali dcE. Takšne rdeče krvne celice lahko povzročijo imunski odziv, ko se prelijejo na prejemnike s skupino dce, zato priporočamo testiranje krvi Rh-negativnih darovalcev z reagenti anti-C in anti-E (ali anti-CE).

Krvno testiranje prejemnika D u pri posrednem Coombsovem testu ni obvezno.

Določitev Rhesus krvi.

Pripadnost rezusu se določi v reakciji aglutinacije z uporabo monoklonskih reagentov ali aloimunskih anti-Rh serumov. Metoda določanja je odvisna od razreda protiteles v reagentu: če so v njej prisotna popolna protitelesa (razred IgM), potem se reagent uporablja za določanje Rh faktorja z neposredno aglutinacijo v fiziološkem mediju; če vsebuje nepopolna protitelesa (razred IgG), ga uporabimo pri posrednem testu na antiglobulin, v aglutinacijskem testu v prisotnosti močnih močnih snovi (albumin, želatina itd.) ali z rdečimi krvnimi celicami, zdravljenimi s proteolitičnimi encimi.

Ne glede na metodo, ki se uporablja za določitev Rhesusove pripadnosti, so naslednji nadzori obvezni:
1. s standardnimi Rh-pozitivnih rdečih krvnih celic;
2. S standardnimi Rh negativnimi eritrociti.

I. Ravna aglutinacijska reakcija z uporabo popolnih anti-D IgM protiteles.

Določitev se izvede v sobi z dobro osvetlitvijo. Test daje najboljše rezultate pri uporabi visoke koncentracije rdečih krvnih celic in temperature okoli 37 °, zato je priporočljivo uporabljati ogrevano ploščo. Za študijo z uporabo polne krvi, izpranih rdečih krvnih celic, rdečih krvnih celic v plazmi, serumu, konzervansu ali fiziološki raztopini.

a) Na krožnik ali tableto dajte veliko kapljico (približno 0,1 ml) reagenta.
b) Damo zraven majhno kapljico (približno 0,03 ml) testne krvi (rdeče krvne celice).
c) reagent temeljito pomešajte s krvjo s čisto stekleno palico.
d) Po 10-20 sekundah ploščo nežno razvaljamo. Čeprav se v prvih 30 sekundah pojavi jasna aglutinacija, upoštevajte rezultate reakcije 3 minute po mešanju.
d) Rezultate reakcije zapišite takoj po določitvi.

V prisotnosti aglutinacije je testna kri označena kot Rh-pozitivna. Če je aglutinacija zelo šibka ali je odsotna, je treba darovalce preskusiti z drugim reagentom, ki vsebuje IgG (nepopolna) protitelesa proti D (glej točko III), da ugotovi, ali ta vzorec krvi spada v skupino D u. Pri prejemnikih odkrivanje D u z nepopolnimi protitelesi ni potrebno. Vendar je treba upoštevati, da lahko z rdečimi krvnimi celicami D u C e opazimo šibko aglutinacijo na ravnini. Takšnega prejemnika ne smemo prenašati z Rh-negativno krvjo, saj lahko to povzroči preobčutljivost za antigen "c". V tem primeru je priporočljivo preveriti prisotnost antigena C v prejemniku.

II. Aglutinacijska reakcija z uporabo nepopolnih protiteles proti IgG proti prisotnosti visokih molekulskih dodatkov.

Reakcija poteka bodisi s posebej pripravljenim reagentom, ki že vsebuje ojačevalnik (univerzalni reagent s poliglucinom ali albuminom za ravnino), ali pa med reakcijo dodamo ojačevalnik (reakcija kolutinacije z želatino in vitro).

1. Tehnika nastavljanja aglutinacijske reakcije na ravnini se ne razlikuje od opisane v odstavku I. Vendar lahko univerzalni reagenti povzročijo lažno pozitivno reakcijo z Rh negativnimi eritrociti zaradi snovi z visoko molekulsko maso in lahko povzročijo tudi aglutinacijo rdečih krvnih celic, prevlečenih z različnimi protitelesi (ne proti Rhesus) specifičnost. Zato je treba opraviti vzporedne preskuse z uporabljeno kontrolno raztopino ojačevalnika, vendar brez protiteles proti D. Če kontrolna raztopina povzroči aglutinacijo eritrocitov, potem rezultati testov niso zanesljivi. Določitev ponovite z drugim reagentom.

2. Reakcija kolutinacije z uporabo želatine. Za ta test lahko uporabimo monoklonske reagente in standardni izoimunski serum proti rezusu z nepopolnimi protitelesi. Potrebno je opraviti nadzor z želatinsko raztopino brez antihezijskega reagenta.

a) kapljica pipete 1 (približno 0,05 ml) testne krvi ali suspenzija rdečih krvnih celic (približno 50%) v serumu.
b) Dodajte 2 kapljici (0,1 ml) 10% raztopine želatine, predhodno segrete, da se utekočini pri 46-48 °.
c) Dodajte 2 kapljici (0,1 ml) anti-D reagenta in premešajte.
d) Epruveto postavite v vodno kopel pri temperaturi 46–48o za 5–10 minut ali v termostat na suhem zraku pri isti temperaturi 30 minut.
e) V epruveto nalijemo 5-8 ml fiziološke raztopine in previdno obrnemo epruveto, ki jo zapremo z zamaškom 1-2 krat..
f) Ugotovite prisotnost aglutinatov s pregledom cevi s prostim očesom ali z lupo.
g) Rezultate takoj zapišite..

S pozitivnim rezultatom se aglutinati razlikujejo v obliki agregatov različnih velikosti na prozornem ozadju - kri je Rh-pozitivna. Z negativnim rezultatom v epruveti ni agregatov, vidna je enakomerno obarvana neprozorna suspenzija rdečih krvnih celic - kri je Rh-negativna. Če opazimo drobnozrnata aglutinacija, je treba preskusiti s pomočjo posrednega testa na antiglobulin (glejte odstavek III). Rezultati želatinskega testa so zanesljivi le, če želatina sama po sebi ne povzroči aglutinacije preučenih rdečih krvnih celic in so rezultati kontrol s standardnimi rdečimi krvnimi celicami pričakovani. V primeru neustreznih rezultatov je treba določitev Rhesusove pripadnosti ponoviti z drugim reagentom ali drugim vzorcem želatine. Če želatina sama povzroči aglutinacijo preučenih eritrocitov, potem lahko predpostavimo prisotnost protiteles proti Rhesusu ali druge specifičnosti na njih (to opazimo pri hemolitični bolezni novorojenčka, avtoimunski hemolitični anemiji in nekaterih nalezljivih boleznih). V tem primeru je treba kri poslati na pregled v poseben serološki laboratorij.

III. Indirektni antiglobulinski test (indirektni Coombsov test) z uporabo nepopolnih anti-D protiteles.

a) Pripravimo 2-5% suspenzijo testnih rdečih krvnih celic, ki jih trikrat izperemo v fiziološki fiziološki raztopini. Če želite to narediti, v epruveto damo 5 kapljic (približno 0,25 ml) testne krvi, trikrat speremo s 5-10 ml fiziološke fiziološke raztopine; suspendiramo usedlino eritrocitov v 2-3 ml fiziološke fiziološke raztopine ali po možnosti v 2-3 ml raztopine nizke ionske jakosti - LISS, v kateri je fiksacija protiteles na rdeče krvne celice močnejša in hitrejša kot v fiziološki fiziološki raztopini.
b) Pipetirajte 1 kapljico anti-D reagenta v čisto etiketo.
c) Dodajte 1 kapljico 2-5% suspenzije rdečih krvnih celic (odstavek "a").
d) Mešanico inkubirajte pri 37 ° 30-45 minut (če so rdeče krvne celice v fiziološki raztopini) ali 10-15 minut (če so rdeče krvne celice v LISS).
e) Rdeče krvne celice enkrat (v primeru uporabe monoklonskega reagenta) ali 3-krat (v primeru uporabe imunskega anti-D seruma) speremo z veliko prostornino (5-10 ml) fiziološke fiziološke raztopine. Enkratno pranje je dovoljeno le pri uporabi monoklonskih reagentov. Fiziološko raztopino odstranite v celoti.
f) V oborino dodamo 1 kapljico reaglobulinskega reagenta in dobro premešamo.
g) Centrifuga 15-20 sekund pri 900-1000g (približno 2000-3000 vrt / min).
h) Pelet nežno resuspendirajte in vizualno zaznajte prisotnost aglutinacije.
i) Takoj zapišite rezultate določitve.

V odsotnosti aglutinacije se kri šteje za Rh-negativno, s pozitivno reakcijo - Rh-pozitivno; podskupine D u lahko povzročijo šibko aglutinacijo tudi pri tem zelo občutljivem testu. Pred dodelitvijo darovalca D u Rh-pozitivni zaključek potrdite s kontrolno študijo antiglobulinskega seruma s standardnimi Rh-negativnimi rdečimi krvnimi celicami. Če je kontrolni test pozitiven, interpretacija ni zanesljiva in krvi takšnega darovalca ne bi smeli uporabiti za transfuzijo do končne določitve njegove pripadnosti rezusu..

IV. Aglutinacija rdečih krvnih celic, zdravljenih s proteolitičnimi encimi z uporabo nepopolnih protiteles proti D.

Nepopolna protitelesa lahko povzročijo neposredno aglutinacijo v solnem mediju eritrocitov, obdelanih z bromelinom, papainom, tripsinom in drugimi proteazami. Ta metoda je zelo občutljiva in zanesljiva pri odkrivanju šibkih oblik antigena D. Uporablja se predvsem pri samodejnem določanju krvnih skupin v sistemih tipa Gruppomatik, ki zagotavljajo standardno obdelavo rdečih krvnih celic z encimi in izberejo ustrezno redčenje reagenta, saj je za ta test značilen pojav prozona (zaviranje aglutinacije s prekomernimi protitelesi). Z ročnim določanjem krvnih skupin lahko metodo uporabimo v specializiranih seroloških laboratorijih v različnih modifikacijah, kar v teh smernicah ne omogoča popolnega opisovanja..

METODOLOŠKA PRIPOROČILA ZA IZVAJANJE INDIVIDUALNE ZDRUŽLJIVOSTI KRVNIH DAROVALCEV IN PREJEMNIKA

Namen individualnega preizkusa združljivosti je preprečiti transfuzijo rdečih krvnih celic, ki niso združljive s pacientovim serumom. Testiranje prejemniškega seruma z rdečimi krvnimi celicami nameravanega darovalca je najbolj zanesljiv način prepoznavanja protiteles, ki lahko povzročijo poškodbe transfuzijskih rdečih krvnih celic, reakcij po transfuziji, vključno s hemolitičnimi. Izvajanje takega testa vam omogoča: 1) potrditev združljivosti dajalca in prejemnika z ABO; 2) za ugotavljanje prisotnosti protiteles v serumu prejemnika, usmerjenih proti darovalcem eritrocitnim antigenom.

Posamezna tehnika preizkušanja združljivosti.

V vseh primerih, razen nujnih transfuzij, se test opravi v dveh fazah: prva - brez uporabe reagenta antiglobulina, druga - z antiglobulinskim reagentom ali z uporabo želatine. V primeru uporabe želatine je metoda manj občutljiva. V nujnih transfuzijah je priporočljivo dvostopenjsko določanje z raztopino nizke ionske jakosti (LISS).

1. V epruveto z oznako položite 2 kapljici prejemnega seruma.
2. Dodajte 1 kapljico 5-odstotne suspenzije trikrat izperenih darovalskih eritrocitov v fiziološki raztopini ali v raztopini LISS z nizko ionsko trdnostjo (fiksacija protiteles je boljša v mediju z nizko ionsko jakostjo, zato je bolje, da se rdeče krvne celice tehtajo v raztopini LISS, ki jo ponavadi proizvajalec z antiglobulinskim reagentom).
3. centrifugirajte takoj pri 2000 vrt./min. 15-20 sekund.
4. Preglejte supernatant glede hemolize. Cev nežno tresemo, ločimo celično peletno od dna epruvete in ugotovimo, ali so prisotni aglutinati. Prisotnost hemolize in / ali aglutinatov v tej fazi lahko pomeni: a) nezdružljivost v sistemu ABO; b) prisotnost prejemnikov v serumu polnih protiteles, ki niso specifična za ABO, aktivnih pri sobni temperaturi (anti-S, anti-P1, anti-M itd.).

Druga stopnja z antiglobulinskim reagentom

5. Če je bila hemoliza odsotna in so po pretresanju epruveta rdeče krvne celice oblikovale homogeno suspenzijo, inkubirajte epruveto 30-45 minut (z uporabo LISS, čas inkubacije je 10-15 minut) pri 37 ° C.
6. epruveto centrifugirajte kot v koraku 3 in preglejte supernatant na hemolizo in aglutinate. Prisotnost hemolize in / ali aglutinatov (po pretresu epruvete) kaže na prisotnost popolnih toplotnih protiteles proti prejemniku rdečih krvnih celic pri prejemniku.
7. Če je hemoliza in aglutinacija odsotna, je treba rdeče krvne celice izprati 3-4 krat z veliko prostornino (vsaj 5 ml) fiziološke raztopine (nezadostno pranje lahko privede do inaktivacije antiglobulinskega reagenta s serumskim ostankom in lažno negativnim rezultatom); Po zadnjem pranju popolnoma odstranite fiziološko raztopino.
8. Dodajte 1-2 kapljici seruma antiglobulina in dobro premešajte.
9. Cev centrifugirajte, kot je v koraku 3, nežno prelomite kroglico in poglejte, da je v epruveti aglutinate.
Proizvajalec zagotavlja kakovost antiglobulinskega reagenta. Ne uporabljajte reagenta z iztečenim rokom ali po večkratnem zamrzovanju-odtajanju. Koristno je kot kontrola (če dvomite o kakovosti reagenta) za izvajanje antiglobulinskega testa s standardnimi Rh-pozitivnimi in Rh-negativnimi rdečimi krvnimi celicami (glejte Metodološka navodila za določanje Rh krvne pripadnosti).

Druga stopnja pri uporabi želatine

5. Če je bila hemoliza odsotna in so po pretresanju epruveta rdeče krvne celice tvorile homogeno suspenzijo, dodajte 2 kapljici 10% raztopine želatine, segrete do utekočinjanja, in temeljito premešajte.
6. Cev na 46-48 inkubirajte 10 minut v vodni kopeli ali 30 minut v termostatu na suhem zraku.
7. Dodamo 5-8 ml fiziološke raztopine in zaprto epruveto za mešanje nežno obrnemo.
8. Zaznajte aglutinacijo tako, da pogledate cev s prostim očesom ali skozi povečevalno steklo..

Ne uporabljajte želatine, če ne zamrzne v hladilniku, je motna ali tvori kosmiče. Ne zamrzujte želatine. Raztopina želatine ne sme povzročiti nespecifične aglutinacije, zato je treba vsako serijo želatine testirati v nadzoru z nesenzibiliziranimi rdečimi krvnimi celicami.

Če je nujna transfuzija potrebna, je mogoče omejiti le na stopnje 1-4 preskusa združljivosti. V tem primeru je mogoče na ravnini izvesti tudi posamezen preskus združljivosti z mešanjem 1 kapljice prejemnikovega seruma s kapljico donorskih eritrocitov (razmerje med serumom in krvjo mora biti približno 5: 1). V tej izjavi se test združljivosti posameznikov dejansko zmanjša na prepoznavanje združljivosti samo v sistemu ABO.

Za darovalca velja, da je združljiv, če v nobeni stopnji posameznega testa kompatibilnosti ne opazimo hemolize niti aglutinacije. Njihova prisotnost kaže na prisotnost protiteles v serumu prejemnika proti rdečim krvničkam domnevnega darovalca. Takšni prejemniki morajo presaditi rdeče krvne celice, ki ne vsebujejo antigenov, proti katerim so protitelesa usmerjena. Ne smemo pozabiti, da posamezni test združljivosti ne daje informacij o specifičnosti protiteles v serumu prejemnika. Njihovo specifičnost je mogoče ugotoviti le v študijah s skupino natipkanih rdečih krvnih celic..

METODOLOŠKE INFORMACIJE
Navodila za določanje krvnih skupin, ki obstajajo v Rusiji, so trenutno zastarela in ne upoštevajo številnih dosežkov sodobne transfuziologije. V hematološkem znanstvenem centru Ruske akademije medicinskih znanosti se pripravljajo metodološka priporočila ob upoštevanju dosežkov svetovne transfuziologije, ki jih povzemata Svetovna zdravstvena organizacija in Ameriško združenje krvnih bank. Te smernice so predstavljene spodaj..
METODOLOŠKA PRIPOROČILA ZA DOLOČANJE O KRVENIH SKUPINAH
Odobril direktor
Hematološka
Znanstveno središče RAMS
Akademik A.I. Vorobiev
27.04.1999

Kri vsake osebe spada v katero koli od 4 skupin sistema ABO, odvisno od prisotnosti antigenov A in B na rdečih krvnih celicah ter ustreznih protiteles proti A in A proti B v plazmi. V skupini 0 (1) sta oba antigena odsotna, v skupini A (II) - na rdečih krvnih celicah je prisoten le antigen A, v skupini B (III) - le rdeča krvna celica in v skupini AB (IV) - oba sta hkrati prisotna na rdečih krvnih celicah antigen - A in B. Običajno imajo neimunizirani ljudje v plazmi naravna protitelesa proti manjkajočemu antigenu: pri posameznikih skupine 0 (I) protitelesa proti obema antigenoma A in B odkrijeta; pri osebah skupine A (II) - protitelesa proti B; v skupini B (III), protitelesa proti A in nazadnje v skupini AB (IV) protitelesa tega sistema v plazmi ni. Zaradi dejstva, da je kompatibilnost s sistemom ABO najpomembnejša pri izvajanju transfuzij krvi, je treba določiti krvno skupino sistema ABO s prečnim presekom, tj. eritrocitni antigeni in protitelesa v plazmi (serum). Vzporedna študija antigenov rdečih krvnih celic in aglutininov v serumu je obvezna za dajalce in prejemnike. Pri transfuziji krvi lahko glede na vitalne indikacije prejemniško skupino določimo le z eritrocitnimi antigeni, hkrati pa se naredi test za posamezno združljivost prejemnikovega seruma z donatorskimi eritrociti. Upoštevati je treba, da obstajajo sorte antigena B in v večji meri antigena A. Najpogostejši sorti antigena A sta A1 in A2. Antigen A2 se pojavlja pri približno 20% ljudi v skupinah A (II) in AB (IV). Pri rutinskem tipkanju ni potrebe po posebni dodelitvi podskupin A2 (II) in A2B (IV), saj ljudje z antigenom A2 običajno nimajo protiteles proti antigenu A1 in jih je mogoče transfuzirati po splošnih pravilih. Prisotnost takšnih "presežnih" protiteles odkrijemo s navzkrižnim določanjem krvne skupine in v vzorcu za posamezno združljivost. Pogostost pojava protiteles anti-A1 je 1-8% pri ljudeh skupine A2 (II) in 22-35% pri ljudeh A2B (IV). Če pri takšnih ljudeh odkrijemo protitelesa proti A1, je koristno potrditi prisotnost antigena A2 s posebnimi reagenti (monoklonski reagent proti antigenu A1 ali Dolichos biflorus lektin), ki aglutinirajo samo A1 rdeče krvne celice. Pri posameznikih iz skupin A2 (II) in A2B (IV) z anti-A1 protitelesi lahko rdeče krvne celice prelijemo samo z antigeni A2 ali A2B.

Aglutinini anti-A (alfa) in anti-B (beta) se določijo v neposredni reakciji aglutinacije standardnih rdečih krvnih celic A1 in B s testnim serumom.

Antigene proučenih rdečih krvnih celic določimo v reakciji neposredne aglutinacije z uporabo standardnih reagentov, ki vsebujejo popolna protitelesa proti A in / ali anti-B. Ti reagenti so lahko aloimunski serumi, pridobljeni od imunskih darovalcev, ali monoklonska protitelesa. Uporaba izohemaglutinirajočih serumov neimunskih darovalcev ni priporočljiva zaradi njihove nezadostne aktivnosti proti šibkim različicam antigenov in nestandardnih.

Uporabljeni standardni reagenti morajo biti certificirani v skladu z mednarodnimi zahtevami. Certificiranje standardov izvaja referenčni laboratorij Znanstvenega centra za hematologijo enkrat letno za vsako ustanovo, ki proizvaja reagente za tipkanje. Institucija standardizira vsako serijo reagenta v skladu s certificiranim standardom. Standardi morajo izpolnjevati naslednje zahteve: 1). biti specifičen; 2). imajo v testnem testu vsaj 1: 1024 za anti-A in anti-B reagente z rdečimi krvnimi celicami A1 in B; 3). v testnem testu ima titer vsaj 1: 256 za reagent anti-A z rdečimi krvnimi celicami A; 4). povzroči jasno aglutinacijo na ravnini 2-3 sekunde po mešanju reagentov z izpranimi rdečimi krvnimi celicami A1 ali B in najpozneje 5 sekund po mešanju z opranimi rdečimi krvnimi celicami A2.

Krvno skupino darovalcev določi zdravnik ali laboratorijski asistent 2-krat: enkrat ob začetnem zdravljenju darovalca in drugič ob sprejemu k dajalcu. Rezultati obeh določitev se zapišejo na sprednji strani revije darovalca, pri čemer se navede datum in podpišejo osebe, ki so določile krvno skupino. V prihodnosti se krvna skupina določi pred vsako preskrbo s krvjo.

Krvno skupino prejemnikov določi certificirani transfuziolog ali posebej usposobljena medicinska sestra. Rezultati določanja krvne skupine se zabeležijo v zgornjem desnem kotu sprednjega lista zdravstvene anamneze, pri čemer se navede datum in podpiše specialist, ki je opravil določitev. Določitev krvne skupine se ponovi pred transfuzijo..
Ugotavljanje krvne skupine ABO s prečnim prerezom.

I. Določanje antigenov A in B rdečih krvnih celic z imunskimi poliklonalnimi serumi ali monoklonskimi reagenti.

Krvno tipkanje je treba izvesti z dvema serijama anti-A in anti-B reagentov ali po eno serijo vsakega reagenta, če se uporablja tudi anti-AB reagent, kar je dodaten nadzor pravilne določitve krvne skupine ABO z anti-A in anti-B reagenti.
Določitev se izvede v sobi z dobro osvetlitvijo pri temperaturi 15-25 °. Za raziskavo z uporabo polne krvi, izpranih rdečih krvnih celic, rdečih krvnih celic v plazmi, serumu ali fiziološki raztopini.
1. Označite odseke na plošči ali plošči z imenom reagenta.
2. Dajte po 1 veliko kapljico (približno 0,1 ml) vsakega reagenta: anti-A, anti-B in anti-AB.
3. Poleg vsakega reagenta dajte 1 majhno kapljico (približno 0,03 ml) testne krvi (rdečih krvnih celic).
4. Zmešajte vsako kapljico krvi (rdeče krvne celice) z ustreznim reagentom v ločenih čistih steklenih palicah..
5. Nežno zibajte ploščo. Kljub temu, da pri uporabi standardnih reagentov pride do jasne aglutinacije že v prvih sekundah, upoštevajte rezultate reakcije 3 minute po koncu mešanja, da ne bi zamudili šibkih oblik antigenov.
6. Rezultate reakcije zapišite takoj po določitvi..

II. Določitev aglutininov anti-A in anti-B v krvnem serumu s standardnimi rdečimi krvnimi celicami.

Kot standardne rdeče krvne celice je treba uporabiti eritrocite darovalcev skupin A1 in B. Rdeče krvne celice se hranijo v hladilniku največ en teden. V posebnem konzervansu se lahko poveča rok uporabnosti rdečih krvnih celic. Uporaba liziranih rdečih krvnih celic ni dovoljena. Uporabite lahko rdeče krvne celice enega predhodno vpisanega darovalca (za vsako skupino) ali mešanico rdečih krvnih celic od 2-3 darovalcev (za vsako skupino).
1. Pripravite 5% suspenzijo v fiziološki raztopini standardnih rdečih krvnih celic, ko ste enkrat izpereni v fiziološki raztopini.
2. V dve epruveti damo 2 kapljici testnega seruma (plazme).
3. Dodajte 1 kapljico 5% suspenzije rdečih krvnih celic skupine A v epruveto A in kapljico rdečih krvnih celic skupine B v epruveto B, temeljito premešajte in 5 minut inkubirajte pri sobni temperaturi..
4. Centrifugirajte epruvete pri 2000 vrt./min. 30 sekund (priporočljivo je izbrati optimalni čas in hitrost centrifugiranja za uporabljeno centrifugo, tako da se usedlina zlahka loči od dna cevi).
5. Stresajte epruveto, olupite od spodaj in nežno stresite usedlino eritrocita.
6. Določite prisotnost aglutinatov tako, da cev pogledate v svetlobo..
7. Zapišite rezultate določitve..

III. Interpretacija rezultatov in vzpostavitev krvne skupine

IV. Neskladje med rezultati določanja krvne skupine ABO po eritrocitnih antigenih in serumskih aglutininih.

Če se rezultati obeh testov pri pregledu krvi darovalca ne ujemajo, te krvi ni mogoče uporabiti za transfuzijo, dokler se ne ugotovijo razlogi za odstopanje.

Če se neskladje nanaša na kri prejemnika, ki potrebuje nujno transfuzijo krvi, mu mora nato preliti kri (rdeče krvne celice) skupine 0 (1), ki je združljiva s faktorjem Rh.

Glavni vzroki napak

1. Tehnične napake: uporaba kontaminirane opreme; napačno razmerje seruma in celic; premočno centrifugiranje (lažno pozitivno); nezadostno centrifugiranje (lažno negativen rezultat); kontaminacija standardnih reagentov z reagenti druge skupine; izvedba reakcije pri temperaturi nad 25 ° (lažno negativen rezultat); nepravilno označevanje reagentov, rdečih krvnih celic ali napačno beleženje rezultatov.

2. Napake, povezane z nenormalnimi lastnostmi testiranih rdečih krvnih celic:
- šibke oblike antigena A (pogosteje) ali B. Serum lahko vsebuje dodatna protitelesa, ustrezen antigen na rdečih krvnih celicah pa ni zaznan. Potrebno je opraviti drugo študijo rdečih krvnih celic z uporabo drugih serij reagentov in druge laboratorijske steklovine. Priporočljivo je, da preučenih rdečih krvnih celic večkrat operemo in čas registracije povečate na 5 minut. Če rezultati ob ponovnem določanju ne sovpadajo, je treba takšno kri poslati v specializiran serološki laboratorij na pregled.
- poliaglutinabilnost eritrocitov, kadar vsi reagenti ABO povzročajo isto aglutinacijo. V tem primeru je treba preveriti, ali preučeni eritrociti aglutinirajo v standardnem serumu skupine AB (IV) (če je tipkanje izvajal imunski serum) ali v fiziološki fiziološki raztopini (če so bili uporabljeni monokloni). Običajno lahko poliaglutinacijo odpravimo s ponovnim umivanjem rdečih krvnih celic..
- nastanek "kovancev kovancev" je mogoče zamenjati za aglutinacijo. V tem primeru, ko dodamo 1-2 kapljice fiziološke raztopine in ploščo stresemo, ponavadi lažna aglutinacija izgine..
- mešana aglutinacija (krvna himera), ko se del rdečih krvnih celic nabere v aglutinatih, ostali pa ostanejo prosti. Najpogosteje to opazimo pri bolnikih skupin A, B ali AB v 1–3 mesecih po transfuziji velikih količin krvi skupine 0 (1) ali po presaditvi kostnega mozga skupine 0 (1); manj pogosto - pri heterogenih dvojčkih. Temeljita zgodovina hitro razkrije to situacijo..
- eritrociti, občutljivi na protitelesa in / ali dopolnjujejo pri hemolitični bolezni novorojenčka, avtoimunskih in nalezljivih boleznih. Takšne rdeče krvne celice lahko spontano aglutinirajo z imunskimi serumi. Določitev ponovimo z monoklonskimi reagenti, damo neposredni Coombsov test (glej spodaj).

3. Napake, povezane z nenormalnimi lastnostmi preskusnega seruma:
- standardne rdeče krvne celice v prisotnosti testnega seruma tvorijo kovanske kolone, kar lahko vzamemo kot pozitiven rezultat. Dodajanje 1-2 kapljic fiziološke raztopine v epruveto in nežno drsenje običajno uniči kovance kovancev, ne pa pravih aglutinat. Nepravilni rezultat reakcije potrdite tako, da ponovite s standardnimi rdečimi krvnimi celicami skupine 0 (1).
- v serumu ni protiteles proti A ali A proti B, kar opažamo pri novorojenčkih, pa tudi pri bolnikih s hudimi motnjami imunskega sistema. Zaključek o krvni skupini je narejen glede na rezultate študije antigenov rdečih krvnih celic.
- protitelesa drugačne specifičnosti ali prekomerna protitelesa so prisotna v serumu (na primer anti-A1 pri ljudeh s šibkim antigenom A2). Rezultat testa združljivosti (glej Smernice za izvajanje posameznega testa združljivosti krvi dajalca in prejemnika) je v takih primerih edino merilo za odvzem krvi.

METODOLOŠKA PRIPOROČILA ZA DOLOČANJE DODATKOV ZA KRVENO REZULTATO

Na človeških rdečih krvnih celicah je 5 glavnih antigenov Rhesusovega sistema (D, C, c, E, e), od katerih je najbolj imunogen antigen D [njegova celotna oznaka je Rh 0 (D)]. Prisotnost ali odsotnost tega antigena določa Rhesusovo pripadnost krvi: osebe, ki vsebujejo D-antigen, spadajo v skupino pozitivnih rezusov (približno 85% bele rase); osebe, ki ne vsebujejo D-antigena, so Rh-negativne (približno 15%).

Imunogenost drugih (manjših) Rh antigenov je znatno nižja in se zmanjša v naslednjem vrstnem redu: c> E> C> e. Določanje manjših antigenov Rhesusovega sistema se običajno izvede s posamično izbiro krvi za več transfuzij, v primerih, ko se v serumu prejemnika odkrijejo imunska protitelesa proti Rh antigenom, pa tudi pri ženskah v rodni dobi..

Antigen D ima šibke različice, združene v skupino D u, kar predstavlja približno 1% populacije. Rdeče krvne celice D u šibko ali sploh ne aglutinirane s polnimi anti-Rh protitelesi v neposredni aglutinacijski reakciji. Za njihovo določitev je treba v reakciji aglutinacije z antiglobulinskim reagentom (indirektni Coombsov test) uporabiti nepopolna protitelesa proti rezusu. Krvodajalci in prejemniki se različno testirajo na prisotnost antigena D u.

Darovalce, ki vsebujejo D u, je treba razvrstiti med Rh-pozitivne, saj lahko transfuzija njihove krvi z Rh-senzibiliziranih Rh-negativnih prejemnikov povzroči hude transfuzijske reakcije. Krvodajalce je treba testirati na prisotnost D u in jih, če jih odkrijemo, razvrstiti kot Rh-pozitivne.

Večina negativnih rezusnih posameznikov ima fenotip dce, vendar pa 2-5% posameznikov, ki ne prenašajo antigena D na rdeče krvne celice in rezus-negativne po definiciji, ima fenotip dCe ali dcE. Takšne rdeče krvne celice lahko povzročijo imunski odziv, ko se prelijejo na prejemnike s skupino dce, zato priporočamo testiranje krvi Rh-negativnih darovalcev z reagenti anti-C in anti-E (ali anti-CE).

Krvno testiranje prejemnika D u pri posrednem Coombsovem testu ni obvezno.

Določitev Rhesus krvi.

Pripadnost rezusu se določi v reakciji aglutinacije z uporabo monoklonskih reagentov ali aloimunskih anti-Rh serumov. Metoda določanja je odvisna od razreda protiteles v reagentu: če so v njej prisotna popolna protitelesa (razred IgM), potem se reagent uporablja za določanje Rh faktorja z neposredno aglutinacijo v fiziološkem mediju; če vsebuje nepopolna protitelesa (razred IgG), ga uporabimo pri posrednem testu na antiglobulin, v aglutinacijskem testu v prisotnosti močnih močnih snovi (albumin, želatina itd.) ali z rdečimi krvnimi celicami, zdravljenimi s proteolitičnimi encimi.

Ne glede na metodo, ki se uporablja za določitev Rhesusove pripadnosti, so naslednji nadzori obvezni:
1. s standardnimi Rh-pozitivnih rdečih krvnih celic;
2. S standardnimi Rh negativnimi eritrociti.

I. Ravna aglutinacijska reakcija z uporabo popolnih anti-D IgM protiteles.

Določitev se izvede v sobi z dobro osvetlitvijo. Test daje najboljše rezultate pri uporabi visoke koncentracije rdečih krvnih celic in temperature okoli 37 °, zato je priporočljivo uporabljati ogrevano ploščo. Za študijo z uporabo polne krvi, izpranih rdečih krvnih celic, rdečih krvnih celic v plazmi, serumu, konzervansu ali fiziološki raztopini.

a) Na krožnik ali tableto dajte veliko kapljico (približno 0,1 ml) reagenta.
b) Damo zraven majhno kapljico (približno 0,03 ml) testne krvi (rdeče krvne celice).
c) reagent temeljito pomešajte s krvjo s čisto stekleno palico.
d) Po 10-20 sekundah ploščo nežno razvaljamo. Čeprav se v prvih 30 sekundah pojavi jasna aglutinacija, upoštevajte rezultate reakcije 3 minute po mešanju.
d) Rezultate reakcije zapišite takoj po določitvi.

V prisotnosti aglutinacije je testna kri označena kot Rh-pozitivna. Če je aglutinacija zelo šibka ali je odsotna, je treba darovalce preskusiti z drugim reagentom, ki vsebuje IgG (nepopolna) protitelesa proti D (glej točko III), da ugotovi, ali ta vzorec krvi spada v skupino D u. Pri prejemnikih odkrivanje D u z nepopolnimi protitelesi ni potrebno. Vendar je treba upoštevati, da lahko z rdečimi krvnimi celicami D u C e opazimo šibko aglutinacijo na ravnini. Takšnega prejemnika ne smemo prenašati z Rh-negativno krvjo, saj lahko to povzroči preobčutljivost za antigen "c". V tem primeru je priporočljivo preveriti prisotnost antigena C v prejemniku.

II. Aglutinacijska reakcija z uporabo nepopolnih protiteles proti IgG proti prisotnosti visokih molekulskih dodatkov.

Reakcija poteka bodisi s posebej pripravljenim reagentom, ki že vsebuje ojačevalnik (univerzalni reagent s poliglucinom ali albuminom za ravnino), ali pa med reakcijo dodamo ojačevalnik (reakcija kolutinacije z želatino in vitro).

1. Tehnika nastavljanja aglutinacijske reakcije na ravnini se ne razlikuje od opisane v odstavku I. Vendar lahko univerzalni reagenti povzročijo lažno pozitivno reakcijo z Rh negativnimi eritrociti zaradi snovi z visoko molekulsko maso in lahko povzročijo tudi aglutinacijo rdečih krvnih celic, prevlečenih z različnimi protitelesi (ne proti Rhesus) specifičnost. Zato je treba opraviti vzporedne preskuse z uporabljeno kontrolno raztopino ojačevalnika, vendar brez protiteles proti D. Če kontrolna raztopina povzroči aglutinacijo eritrocitov, potem rezultati testov niso zanesljivi. Določitev ponovite z drugim reagentom.

2. Reakcija kolutinacije z uporabo želatine. Za ta test lahko uporabimo monoklonske reagente in standardni izoimunski serum proti rezusu z nepopolnimi protitelesi. Potrebno je opraviti nadzor z želatinsko raztopino brez antihezijskega reagenta.

a) kapljica pipete 1 (približno 0,05 ml) testne krvi ali suspenzija rdečih krvnih celic (približno 50%) v serumu.
b) Dodajte 2 kapljici (0,1 ml) 10% raztopine želatine, predhodno segrete, da se utekočini pri 46-48 °.
c) Dodajte 2 kapljici (0,1 ml) anti-D reagenta in premešajte.
d) Epruveto postavite v vodno kopel pri temperaturi 46–48o za 5–10 minut ali v termostat na suhem zraku pri isti temperaturi 30 minut.
e) V epruveto nalijemo 5-8 ml fiziološke raztopine in previdno obrnemo epruveto, ki jo zapremo z zamaškom 1-2 krat..
f) Ugotovite prisotnost aglutinatov s pregledom cevi s prostim očesom ali z lupo.
g) Rezultate takoj zapišite..

S pozitivnim rezultatom se aglutinati razlikujejo v obliki agregatov različnih velikosti na prozornem ozadju - kri je Rh-pozitivna. Z negativnim rezultatom v epruveti ni agregatov, vidna je enakomerno obarvana neprozorna suspenzija rdečih krvnih celic - kri je Rh-negativna. Če opazimo drobnozrnata aglutinacija, je treba preskusiti s pomočjo posrednega testa na antiglobulin (glejte odstavek III). Rezultati želatinskega testa so zanesljivi le, če želatina sama po sebi ne povzroči aglutinacije preučenih rdečih krvnih celic in so rezultati kontrol s standardnimi rdečimi krvnimi celicami pričakovani. V primeru neustreznih rezultatov je treba določitev Rhesusove pripadnosti ponoviti z drugim reagentom ali drugim vzorcem želatine. Če želatina sama povzroči aglutinacijo preučenih eritrocitov, potem lahko predpostavimo prisotnost protiteles proti Rhesusu ali druge specifičnosti na njih (to opazimo pri hemolitični bolezni novorojenčka, avtoimunski hemolitični anemiji in nekaterih nalezljivih boleznih). V tem primeru je treba kri poslati na pregled v poseben serološki laboratorij.

III. Indirektni antiglobulinski test (indirektni Coombsov test) z uporabo nepopolnih anti-D protiteles.

a) Pripravimo 2-5% suspenzijo testnih rdečih krvnih celic, ki jih trikrat izperemo v fiziološki fiziološki raztopini. Če želite to narediti, v epruveto damo 5 kapljic (približno 0,25 ml) testne krvi, trikrat speremo s 5-10 ml fiziološke fiziološke raztopine; suspendiramo usedlino eritrocitov v 2-3 ml fiziološke fiziološke raztopine ali po možnosti v 2-3 ml raztopine nizke ionske jakosti - LISS, v kateri je fiksacija protiteles na rdeče krvne celice močnejša in hitrejša kot v fiziološki fiziološki raztopini.
b) Pipetirajte 1 kapljico anti-D reagenta v čisto etiketo.
c) Dodajte 1 kapljico 2-5% suspenzije rdečih krvnih celic (odstavek "a").
d) Mešanico inkubirajte pri 37 ° 30-45 minut (če so rdeče krvne celice v fiziološki raztopini) ali 10-15 minut (če so rdeče krvne celice v LISS).
e) Rdeče krvne celice enkrat (v primeru uporabe monoklonskega reagenta) ali 3-krat (v primeru uporabe imunskega anti-D seruma) speremo z veliko prostornino (5-10 ml) fiziološke fiziološke raztopine. Enkratno pranje je dovoljeno le pri uporabi monoklonskih reagentov. Fiziološko raztopino odstranite v celoti.
f) V oborino dodamo 1 kapljico reaglobulinskega reagenta in dobro premešamo.
g) Centrifuga 15-20 sekund pri 900-1000g (približno 2000-3000 vrt / min).
h) Pelet nežno resuspendirajte in vizualno zaznajte prisotnost aglutinacije.
i) Takoj zapišite rezultate določitve.

V odsotnosti aglutinacije se kri šteje za Rh-negativno, s pozitivno reakcijo - Rh-pozitivno; podskupine D u lahko povzročijo šibko aglutinacijo tudi pri tem zelo občutljivem testu. Pred dodelitvijo darovalca D u Rh-pozitivni zaključek potrdite s kontrolno študijo antiglobulinskega seruma s standardnimi Rh-negativnimi rdečimi krvnimi celicami. Če je kontrolni test pozitiven, interpretacija ni zanesljiva in krvi takšnega darovalca ne bi smeli uporabiti za transfuzijo do končne določitve njegove pripadnosti rezusu..

IV. Aglutinacija rdečih krvnih celic, zdravljenih s proteolitičnimi encimi z uporabo nepopolnih protiteles proti D.

Nepopolna protitelesa lahko povzročijo neposredno aglutinacijo v solnem mediju eritrocitov, obdelanih z bromelinom, papainom, tripsinom in drugimi proteazami. Ta metoda je zelo občutljiva in zanesljiva pri odkrivanju šibkih oblik antigena D. Uporablja se predvsem pri samodejnem določanju krvnih skupin v sistemih tipa Gruppomatik, ki zagotavljajo standardno obdelavo rdečih krvnih celic z encimi in izberejo ustrezno redčenje reagenta, saj je za ta test značilen pojav prozona (zaviranje aglutinacije s prekomernimi protitelesi). Z ročnim določanjem krvnih skupin lahko metodo uporabimo v specializiranih seroloških laboratorijih v različnih modifikacijah, kar v teh smernicah ne omogoča popolnega opisovanja..

METODOLOŠKA PRIPOROČILA ZA IZVAJANJE INDIVIDUALNE ZDRUŽLJIVOSTI KRVNIH DAROVALCEV IN PREJEMNIKA

Namen individualnega preizkusa združljivosti je preprečiti transfuzijo rdečih krvnih celic, ki niso združljive s pacientovim serumom. Testiranje prejemniškega seruma z rdečimi krvnimi celicami nameravanega darovalca je najbolj zanesljiv način prepoznavanja protiteles, ki lahko povzročijo poškodbe transfuzijskih rdečih krvnih celic, reakcij po transfuziji, vključno s hemolitičnimi. Izvajanje takega testa vam omogoča: 1) potrditev združljivosti dajalca in prejemnika z ABO; 2) za ugotavljanje prisotnosti protiteles v serumu prejemnika, usmerjenih proti darovalcem eritrocitnim antigenom.

Posamezna tehnika preizkušanja združljivosti.

V vseh primerih, razen nujnih transfuzij, se test opravi v dveh fazah: prva - brez uporabe reagenta antiglobulina, druga - z antiglobulinskim reagentom ali z uporabo želatine. V primeru uporabe želatine je metoda manj občutljiva. V nujnih transfuzijah je priporočljivo dvostopenjsko določanje z raztopino nizke ionske jakosti (LISS).

1. V epruveto z oznako položite 2 kapljici prejemnega seruma.
2. Dodajte 1 kapljico 5-odstotne suspenzije trikrat izperenih darovalskih eritrocitov v fiziološki raztopini ali v raztopini LISS z nizko ionsko trdnostjo (fiksacija protiteles je boljša v mediju z nizko ionsko jakostjo, zato je bolje, da se rdeče krvne celice tehtajo v raztopini LISS, ki jo ponavadi proizvajalec z antiglobulinskim reagentom).
3. centrifugirajte takoj pri 2000 vrt./min. 15-20 sekund.
4. Preglejte supernatant glede hemolize. Cev nežno tresemo, ločimo celično peletno od dna epruvete in ugotovimo, ali so prisotni aglutinati. Prisotnost hemolize in / ali aglutinatov v tej fazi lahko pomeni: a) nezdružljivost v sistemu ABO; b) prisotnost prejemnikov v serumu polnih protiteles, ki niso specifična za ABO, aktivnih pri sobni temperaturi (anti-S, anti-P1, anti-M itd.).

Druga stopnja z antiglobulinskim reagentom

5. Če je bila hemoliza odsotna in so po pretresanju epruveta rdeče krvne celice oblikovale homogeno suspenzijo, inkubirajte epruveto 30-45 minut (z uporabo LISS, čas inkubacije je 10-15 minut) pri 37 ° C.
6. epruveto centrifugirajte kot v koraku 3 in preglejte supernatant na hemolizo in aglutinate. Prisotnost hemolize in / ali aglutinatov (po pretresu epruvete) kaže na prisotnost popolnih toplotnih protiteles proti prejemniku rdečih krvnih celic pri prejemniku.
7. Če je hemoliza in aglutinacija odsotna, je treba rdeče krvne celice izprati 3-4 krat z veliko prostornino (vsaj 5 ml) fiziološke raztopine (nezadostno pranje lahko privede do inaktivacije antiglobulinskega reagenta s serumskim ostankom in lažno negativnim rezultatom); Po zadnjem pranju popolnoma odstranite fiziološko raztopino.
8. Dodajte 1-2 kapljici seruma antiglobulina in dobro premešajte.
9. Cev centrifugirajte, kot je v koraku 3, nežno prelomite kroglico in poglejte, da je v epruveti aglutinate.
Proizvajalec zagotavlja kakovost antiglobulinskega reagenta. Ne uporabljajte reagenta z iztečenim rokom ali po večkratnem zamrzovanju-odtajanju. Koristno je kot kontrola (če dvomite o kakovosti reagenta) za izvajanje antiglobulinskega testa s standardnimi Rh-pozitivnimi in Rh-negativnimi rdečimi krvnimi celicami (glejte Metodološka navodila za določanje Rh krvne pripadnosti).

Druga stopnja pri uporabi želatine

5. Če je bila hemoliza odsotna in so po pretresanju epruveta rdeče krvne celice tvorile homogeno suspenzijo, dodajte 2 kapljici 10% raztopine želatine, segrete do utekočinjanja, in temeljito premešajte.
6. Cev na 46-48 inkubirajte 10 minut v vodni kopeli ali 30 minut v termostatu na suhem zraku.
7. Dodamo 5-8 ml fiziološke raztopine in zaprto epruveto za mešanje nežno obrnemo.
8. Zaznajte aglutinacijo tako, da pogledate cev s prostim očesom ali skozi povečevalno steklo..

Ne uporabljajte želatine, če ne zamrzne v hladilniku, je motna ali tvori kosmiče. Ne zamrzujte želatine. Raztopina želatine ne sme povzročiti nespecifične aglutinacije, zato je treba vsako serijo želatine testirati v nadzoru z nesenzibiliziranimi rdečimi krvnimi celicami.

Če je nujna transfuzija potrebna, je mogoče omejiti le na stopnje 1-4 preskusa združljivosti. V tem primeru je mogoče na ravnini izvesti tudi posamezen preskus združljivosti z mešanjem 1 kapljice prejemnikovega seruma s kapljico donorskih eritrocitov (razmerje med serumom in krvjo mora biti približno 5: 1). V tej izjavi se test združljivosti posameznikov dejansko zmanjša na prepoznavanje združljivosti samo v sistemu ABO.

Za darovalca velja, da je združljiv, če v nobeni stopnji posameznega testa kompatibilnosti ne opazimo hemolize niti aglutinacije. Njihova prisotnost kaže na prisotnost protiteles v serumu prejemnika proti rdečim krvničkam domnevnega darovalca. Takšni prejemniki morajo presaditi rdeče krvne celice, ki ne vsebujejo antigenov, proti katerim so protitelesa usmerjena. Ne smemo pozabiti, da posamezni test združljivosti ne daje informacij o specifičnosti protiteles v serumu prejemnika. Njihovo specifičnost je mogoče ugotoviti le v študijah s skupino natipkanih rdečih krvnih celic..